Chito-Oligo Saccharide (COS)
Chito-Oligo Saccharide (COS)
2013
ไคติน คือสายโพลิเมอร์ที่ประกอบขึ้นจากน้ำตาล N-acetyl-D-glucosamine (GlcNAc) เชื่อมต่อกันด้วยพันธะ β-1,4 glycosidic (รูปที่ 1a) ต่อกันเป็นโครงสร้างของผลึกที่แข็งแรง ไคตินเป็นโพลิเมอร์ที่พบในธรรมชาติมากเป็นดับสองรองจากเซลลูโลส พบในส่วนประกอบหลักของผนังเซลล์ของเชื้อรา, ยีสต์ นอกจากนี้ยังพบในโครงร่างภายนอกของแมลงและ กุ้ง กั้ง ปู และ แกนปลาหมึก
ไคโตซาน คืออนุพันธ์ของไคติน ผลิตโดยแช่ไคตินในสารละลายด่างเข้มข้น จะทำให้เกิดปฏิกริยา deacetylation โดยดึงหมู่ acetyl ออกจากสายของไคติน (Maria Hayes, 2008) ไคโตซานสามารถละลายได้ในสารละลายกรดอ่อนในช่วง pH ≤ 6.5 โครงสร้างของไคโตซานประกอบด้วยน้ำตาล Glucosamine (GlcN) และ GlcNAc อยู่รวมในสายเดียวกัน (รูปที่ 1b) เราสามารถจำแนกประเภทของไคโตซานได้จาก เปอร์เซ็นต์การดึงหมู่ acetyl (deacetylation), ระดับการเกิดโพลีเมอร์ (polymerization), น้ำหนักโมเลกุล และรูปแบบของหมู่ acetylation ในสายโพลิเมอร์ (Aam et al., 2010) ไคโตซานเป็นสารชีวภาพที่มีคุณสมบัติทางชีวภาพที่น่าสนใจคือ ไม่เป็นพิษ สามารถย่อยสลายได้ ปัจจุบันมีการนำไคโตซานมาใช้ประโยชน์มากมาย ในด้านการเกษตร การแพทย์ และอาหาร เป็นต้น
ไคโตโอลิโกแซคคอไรด์ หรือ คอซ คือสายน้ำตาลที่เกิดจากการย่อยสลายไคติน และ ไคโตซาน ด้วยปฏิกิริยาเคมีโดยใช้กรด หรือ ปฏิกิริยาเอนไซม์โดยใช้เอนไซม์ในกลุ่มไคติโนไลติค(Chitinolytic enzyme) เช่น ไคติเนส (chitinase) และไคโตซานเนส (chitosanase) คุณสมบัติที่โดดเด่นของ คอซ คือ สามารถละลายน้ำได้ และมีประสิทธิภาพในการดูดซึมได้มากกว่า ไคโตซาน ซึ่งมีข้อจำกัดในการละลายในกรดอ่อน และ มีความหนืดมาก ดังนั้น คอซจึงมีมูลค่าสูงกว่า ไคติน และ ไคโตซานมาก
ในปัจจุบันมีการศึกษาวิจัยถึงประโยชน์ของ คอซ ในด้านต่างๆ มากมาย เช่น คุณสมบัติความเป็นพรีไบโอติก การกระตุ้นการเจริญเติบโตของพืช ใช้สารเสริมในอาหารสัตว์ นอกจากนี้ คอซ มีคุณสมบัติกระตุ้นระบบภูมิคุ้มกันโรคพืช ซึ่งมีการศึกษาวิจัยในพืชหลายชนิด เช่น ยาสูบ แคโนลา องุ่น และ ข้าว เป็นต้น (Yin et al., 2010) ซึ่งผู้เขียนจะ ขอกล่าวเฉพาะการใช้ ไคติน ไคโตซาน และคอซ ในการกระตุ้นระบบภูมิคุ้มกันในพืช ซึ่งเป็นการเพิ่มผลผลิตทางการเกษตร
พืชมีกลไกของระบบภูมิคุ้มกันที่ซับซ้อนในการปรับตัวต่อ ความเครียดจากสิ่งมีชีวิต (biotic stress) เช่น เชื้อรา แบคทีเรีย และแมลง และความเครียดจากสิ่งไม่มีชีวิต (abiotic stress) เช่น การเกิดแผล ความเค็มของดิน และสภาพอากาศที่ไม่เหมาะสม ซึ่ง พืชสามารถต้านทานต่อความเครียดเหล่านี้ได้โดยใช้ระบบภูมิคุ้มกันที่มีมาแต่กำเนิด (innate immunity) ซึ่งเป็นระบบภูมิคุ้มกันที่ไม่จำเพาะเจาะจง ก่อให้เกิดปฏิกิริยาการต้านทางต่อความเครียดเหล่านี้ เช่น พืชสามารถถูกกระตุ้นให้ผลิต การผลิต ไฟโตอเล็กซิน (Phytoalexin) ซึ่งเป็นสารอินทรีย์ที่พืชสร้างขึ้นหลังจากเกิดการติดเชื้อ สารนี้จะสร้างในบริเวณที่มีการติดเชื้อ และสะสมมากในเซลล์ที่ตายแล้ว มีฤทธิ์ในการฆ่าทั้งเชื้อก่อโรคและทำลายเซลล์ของพืชเองเพื่อป้องกันไม่ให้โรคลุกลามต่อไป มีรายงานการวิจัยว่า ไคติน ไคโตซาน และ คอซ มีคุณสมบัติเป็นตัวกระตุ้นให้เกิดภูมิคุ้มกันชนิดในพืชได้ ซึ่งผู้เขียนจะขออธิบายถึงกลไกในการกระตุ้นภูมิคุ้มกันเหล่านี้ ซึ่งเป็นกลไกที่มหัศจรรย์และมีความซับซ้อนเป็นอย่างมาก
1. กลไกกระตุ้นภูมิคุ้มกันโรคพืชด้วย ไคติน ไคโตซาน และ คอซ
พืชมีกลไกในการจดจำจุลชีพ โดยจดจำจุลชีพที่เข้ามาบุกรุกด้วยโปรตีนตัวรับ (receptor) โปรตีนตัวรับจะได้รับการกระตุ้นให้เกิดการต้านทานต่อจุลชีพ เมื่อพบส่วนประกอบต่างๆในจุลชีพ เช่น ไคตินในผนังเซลล์ของเชื้อรา และ แฟลกแจล (Flagella) เป็นระยางค์ที่ใช้ในการเครื่อนที่ของแบคทีเรีย ตัวอย่างของโปรตีนตัวรับที่พบในพืช คือ MAMPs (Microbe-Associated Molecular Pattern) และ PAMPs (Microbe-Associated Molecular Pattern) ซึ่งตัวรับดังกล่าวถือว่าเป็นระบบภูมิคุ้มกันด่านแรกที่บริเวณผิวของเซลล์พืช (Hamel & Beaudoin, 2010)
ไคติน ไคโตซาน และ คอซ สามารถกระตุ้นระบบภูมิคุ้มกันโรคพืช โดยกระตุ้นให้เกิดการแสดงออกของยีนที่เกี่ยวข้องกับการต่อต้านการบุกรุกของจุลชีพก่อโรค การสร้างสารต่อต้านจุลชีพ และ กระตุ้นการสร้างผนังเซลล์ให้มีความแข็งแรงขึ้น มีงานวิจัยที่พยายามศึกษาศึกษากลไกการกระตุ้นภูมิคุ้มพืชด้วยโพลิเมอร์เหล่านี้ นักวิทยาศาสตร์ได้ค้นพบ โปรตีนตัวรับชนิดหนึ่ง มีชื่อว่าโปรตีนตัวรับไคติน (chitin receptor) ที่บริเวณเยื่อหุ้มเซลล์ (plasma membrane) ในเซลล์ของ ของมะเขือเทศ และข้าว (Baureithel et al., 1994; Shibuya et al., 1993) ซึ่งโปรตีนตัวรับไคตินนี้มีคุณสมบัติในการจับอย่างจำเพาะกับ คอซ นอกจากนี้ยังพบในพืชชนิดอื่น เช่น ถั่วเหลือง ข้าวบาร์เล่ย์ ข้าวสาลี และ แครอท (Day et al., 2001; Okada et al., 2002) มีรายงานวิจัยที่ศึกษาโปรตีนตัวรับไคตินในข้าว โดยทำการสกัดโปรตีนจากเยื่อหุ้มเซลล์ของข้าวในสารละลายเซลล์ และทำโปรตีนให้บริสุทธิ์ (Kaku et al., 2006) พบว่าในโครงสร้างของโปรตีนชนิดนี้ มีกลุ่มของกรดอะมิโนไลซิน (Lysin motif domain, LysM) ซึ่งเป็นโปรตีนที่เกี่ยวข้องกับเอนไซม์ที่ใช้การย่อยสลายผนังเซลล์ของเชื้อรา เช่นเอนไซม์มูรามิเดส (muramidase) และไคติเนส (Ohnuma et al., 2008) ซึ่งพืชจะสามารถจดจำและทำลายผนังเซลล์ของจุลชีพได้ในที่สุด
การจดจำจุลชีพของโปรตีนตัวรับไคติน สามารถเหนี่ยวนำให้เกิด การเปลี่ยนแปลงของไอออน และ การเปลี่ยนแปลงอย่างรวดเร็วที่บริเวณเยื่อหุ้มเซลล์ เช่น ทำให้เกิดการสะสมแคลเซียมไออน (Ca2+) ภายในเซลล์ และส่งผลให้เกิด Reactive oxygen species (ROS) ด้วยเอนไซม์ NADPH oxidase ซึ่ง ROS ประกอบไปด้วยสารในรูปอนุมูลอิสระ (O2-, superoxide radicals; OH•, hydroxyl; HO2•, perhydroxy radical และ RO•, alkoxy radical) และอยู่ในรูปโมเลกุลของ H2O2 , hydrogen peroxide และ 1O2 , singlet oxygen อนุมูลอิสระที่เกิดขึ้นจะแตกตัวเป็นลูกโซ่กับสารชีวโมเลกุลภายในเซลล์ และต่อโมเลกุลของจุลชีพที่รุกรานเข้ามา ส่งผลให้บริเวณที่มีการตอบสนอง มีการตายของเซลล์พืชเกิดขึ้น ซึ่งเป็นการทำลายแหล่งอาหาร และยับยั้งการแพร่กระจายของจุลชีพอีกด้วย เรียกกระบวนการนี้ว่า programmed cell death (Gill & Tuteja, 2010)
นอกจากนี้กลไกสำคัญในการควบคุมการแสดงออกของยีนปกป้องพืชคือ Mitogen-activated protein kinase (MAPKs) ได้มีการศึกษาโปรตีนชนิดนี้ด้วยวิธี protein chip พบว่า MAPKs เกี่ยวข้องกับกระบวนการเติมหมู่ฟอสเฟสให้กับ transcription factor (TF) หลากหลายชนิด รวมถึง TF ที่เกี่ยวข้องกับการตอบสนองต่อความเครียดของพืช (Hamel & Beaudoin, 2010) ในปัจจุบันนี้ยังไม่มีการศึกษาในเชิงลึกเกี่ยวกับ TF ที่เกี่ยวข้องกับการส่งสัญญาณของไคติน อย่างไรก็ตาม มีรายงานว่ามีการค้นพบ TF ที่มีความสำคัญในการกระตุ้นกระบวนการส่งสัญญาณ ของคอซ เพื่อปกป้องเซลล์ของข้าว (Chujo et al., 2007) ซึ่งกลไกต่างเหล่านี้ยังต้องทำมีการศึกษากันต่อไปในอนาคต
2. การใช้ไคติน ไคโตซาน และคอซ ในการเกษตร
ปัจจุบันมีการศึกษาวิจัยการใช้ ไคติน ไคโตซาน และคอซ ในการกระตุ้นภูมิคุ้มกันของพืชชนิดต่างๆ ดังนี้
2.1 พืชอาหาร
ข้าวเป็นพืชอาหารที่สำคัญต่อโลกเป็นอย่างมาก มีการศึกษาทดลองใช้ ไคโตซาน ในการกระตุ้นการปกป้องใบเลี้ยงของต้นข้าว พบว่าเมื่อใช้ ไคโตซานความเข้มข้น 0.1% จะทำให้มีการสะสม ROS เกิดขึ้น นอกจากนี้ยังมีการผลิตสารฟีนอลิค (phenolic) ซึ่งเป็น secondary metabolite อีกด้วย นอกจากนี้ยังมีการศึกษาในข้าวสาลี ซึ่งเป็นพืชอาหารที่สำคัญในเขตหนาว โดย ใช้ คอซ ที่มีน้ำหนักโมเลกุล 5-10 kDa และ 65% acetylation ในการควบคุมการติดเชื้อจาก Bipolaris sorokiniana ซึ่งเป็นเชื้อราที่ก่อให้เกิดโรคใบจุดสีน้ำตาลในข้าวสาลี (Burkhanova et al., 2007)
2.2 พืชเศรษฐกิจ
ยาสูบ เป็นพืชเศรษฐกิจที่สำคัญและยังเป็นพืชต้นแบบในการศึกษาวิจัย มีงานวิจัยมากมายที่ทำการศึกษา การต้านทานโรคของยาสูบต่อไวรัสใบยาสูบด่าง(Tobacco Mosaic Virus, TMV) ด้วย คอซ ยกตัวอย่างเช่น เมื่อทำการพ่น คอซ ลงบนใบยาสูบ จะทำให้สามารถต่อต้านการติดเชื้อ TMV โดยความเข้มข้นที่เหมาะสมที่สุดในการยับยั้ง คือ 50 µg/mL เมื่อสังเกตุที่เวลา 24 ชั่วโมง (Zhao et al., 2007) นอกจากนี้ยังมีการศึกษาการกระตุ้นภูมิคุ้มกันโรคใบไหม้ในมันฝรั่ง (late blight disease)โดยใช้ คอซ ที่มีน้ำหนักโมเลกุล 2-6 kDa และ 85% Deacetylation (Ozeretskovskaya et al., 2006)
2.3 พืชผัก
มีรายงานการศึกษาการกระตุ้นภูมิคุ้มกันโรคของ คอซ ในมะเขือเทศต่อ เชื้อรา Phytophthora infestans และ ไส้เดือนฝอยรากปม (root knot nematode) ซึ่งเป็นสาเหตุของโรครากปม (Vasyukova et al., 2001) นอกจากนี้ยังมีการศึกษาถึง การใช้คอซในการต้านทานโรคราเขม่า (grey mould) ในมะเขือเทศ ซึ่งเกิดจากเชื้อรา Bitrytis cinerea พบว่า จะเกิดการยับยั้งการเจริญของเชื้อรา Bitrytis cinerea เมื่อใช้ คอซ ที่ความเข้มข้น 50 µg/mL (Ben-Shalom et al., 2003)
2.4 ผลไม้
องุ่นเป็นผลไม้ที่อุดมไปด้วยคุณค่าทางอาหาร สามารถรับประทานแบบสดๆ หรือนำไปแปรรูปเป็น แยม น้ำผลไม้ ไวน์ และอื่นๆอีกมากมาย แต่การผลิตองุ่นคุณภาพนั้น มักจะประสบปัญหาการบุกรุกของจุลชีพก่อโรคต่างๆ มีการทดลองใช้ คอซ เสมือนเป็นสารกำจัดศัตรูพืชแบบชีวภาพ (Biopesticide) จากผลการทดลอง พบว่า คอซ ที่มีน้ำหนักโมเลกุล 1500 Da และ 80% Deacetylation สามารถลดการติดเชื้อ จาก Plasmopara viticola และBotrytis cinerea ในใบองุ่นได้ โดยใช้ คอซ ปริมาณ 200 µg/ml ซึ่งปริมาณที่เหมาะสมที่สุดในการยับยั้ง Botrytis cinerea คือ 75-150 µg/ml (Aziz et al., 2006)
ไคโตซานและคอซ มีประสิทธิภาพในการต่อต้านโรคในพืชมากมาย ซึ่งประสิทธิภาพในการต้านทานโรค จะขึ้นอยู่กับชนิดของโรคพืชนั้นๆ ปริมาณความเข้มข้น และคุณสมบัติของ ไคโตซาน และ คอซ เช่น % Deacetylation และ Polymerization ซึ่งจะส่งผลให้เกิดการยับยั้งจุลชีพก่อโรคที่แตกต่างกันออกไป จากการศึกษาวิจัยค้นพบว่าควรใช้คอซ กับพืชก่อนที่พืชจะมีการติดเชื้อจากจุลชีพ ทำให้พืชมีความต้านทานโรคได้ดีกว่าใช้เมื่อมีการติดเชื้อแล้ว ดังนั้น คอซ ทำหน้าที่เหมือนกับวัคซีน ที่กระตุ้นภูมิต้านทานให้กับพืช ซึ่งกระบวนการเหนี่ยวนำให้เกิดภูมิต้านทานนี้ยังต้องมีการศึกษาถึงกลไกเหล่านี้ในระดับโมเลกุลต่อไป
สำหรับการใช้ไคโตซาน เพื่อการเกษตรในประเทศไทยของเรามีแนวโน้มเพิ่มขึ้นเป็นอย่างมาก เนื่องจาก เนื่องจาก ไคโตซาน เป็นวัสดุชีวภาพ ที่มีความปลอดภัย ไม่ก่อให้เกิดความเป็นพิษกับทั้งมนุษย์ สัตว์ และพืช นอกจากนั้นยังสามารถย่อยสลายได้เองตามธรรมชาติ ซึ่งปัจจุบันมีการผลิตและวางจำหน่ายผลิตภัณฑ์ไคโตซานเพื่อใช้เป็นปุ๋ยชีวภาพหลากหลายรูปแบบ เช่น แบบผง แบบน้ำ และแบบเม็ด เช่น ยี่ห้อปูแดงไคโตซาน กุ้งหลวงไคโตซาน สตาร์ไคโตซาน และซุปเปอร์ไคโตซาน เป็นต้น ซึ่งผลิตภัณฑ์เหล่านี้มีฤทธิ์ในการ ยับยั้งและสร้างความต้านทานโรคให้กับพืช ได้แก่ เชื้อไวรัส แบคทีเรีย และเชื้อรา และสร้างความต้านทานโรคให้กับพืชที่ไม่ติดเชื้อ ซึ่งวิธีการใช้ และปริมาณการใช้จะขึ้นอยู่กับชนิดของพืชนั้นๆ ส่วนการใช้ผลิตภัณฑ์ คอซ ในทางการเกษตรนั้น ยังไม่เป็นที่แพร่หลายมากนัก เนื่องจากการผลิต คอซ ให้ได้คุณภาพที่ดีนั้น ต้องมีกรรมวิธีการผลิตและการควบคุมการผลิตที่มีประสิทธิภาพ ซึ่งต้องทำการศึกษาวิจัยกันต่อไป อย่างไรก็ตาม ได้มีการผลิตและวางจำหน่ายผลิตภัณฑ์ คอซ ยี่ห้อ นิวเคลียร์ c.o.s. ที่สกัดจากเปลือกกุ้ง และเปลือกปู โดยใช้เอนไซม์ธรรมชาติ โดยศูนย์วัสดุชีวภาพไคติน-ไคโตซาน ได้ทำการศึกษาวิจัยร่วมกับสำนักงานนวัตกรรมแห่งชาติ (NIA) กระทรวงวิทยาศาตร์และเทคโนโลยี ซึ่งมีฤทธิ์เป็นสารเสริม ชักนำ และเร่งการเจริญเติบโตสำหรับพืช ซึ่งเกษตรกรสามารถ เลือกใช้ผลิตภัณฑ์จากไคติน และไคโตซานเพื่อเป็นประโยชน์ในทางการเกษตรได้มากมาย
เอกสารอ้างอิง
1.Aam, B. B., Heggset, E. B., Norberg, A. L., Sørlie, M., Vårum, K. M., & Eijsink, V. G. H. (2010). Production of Chitooligosaccharides and Their Potential Applications in Medicine. Marine Drugs, 8(5), 1482-1517.
2.Aziz, A., Trotel-Aziz, P., Dhuicq, L., Jeandet, P., Couderchet, M., & Vernet, G. (2006). Chitosan Oligomers and Copper Sulfate Induce Grapevine Defense Reactions and Resistance to Gray Mold and Downy Mildew. Phytopathology, 96(11), 1188-1194.
3.Baureithel, K., Felix, G., & Boller, T. (1994). Specific, high affinity binding of chitin fragments to tomato cells and membranes. Competitive inhibition of binding by derivatives of chitooligosaccharides and a Nod factor of Rhizobium. Journal of Biological Chemistry, 269(27), 17931-17938.
4.Ben-Shalom, N., Ardi, R., Pinto, R., Aki, C., & Fallik, E. (2003). Controlling gray mould caused by Botrytis cinerea in cucumber plants by means of chitosan. Crop Protection, 22(2), 285-290.
5.Burkhanova, G. F., Yarullina, L. G., & Maksimov, I. V. (2007). The control of wheat defense responses during infection with Bipolaris sorokiniana by chitooligosaccharides. Russian Journal of Plant Physiology, 54(1), 104-110.
6.Chujo, T., Takai, R., Akimoto-Tomiyama, C., Ando, S., Minami, E., Nagamura, Y., . . . Yamane, H. (2007). Involvement of the elicitor-induced gene OsWRKY53 in the expression of defense-related genes in rice. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Gene Structure and Expression, 1769(7–8), 497-505.
7.Day, R. B., Okada, M., Ito, Y., Tsukada, K., Zaghouani, H., Shibuya, N., & Stacey, G. (2001). Binding site for chitin oligosaccharides in the soybean plasma membrane. Plant Physiol, 126(3), 1162-1173.
8.Gill, S. S., & Tuteja, N. (2010). Reactive oxygen species and antioxidant machinery in abiotic stress tolerance in crop plants. Plant Physiology and Biochemistry, 48(12), 909-930.
9.Hamel, L.-P., & Beaudoin, N. (2010). Chitooligosaccharide sensing and downstream signaling: contrasted outcomes in pathogenic and beneficial plant–microbe interactions. Planta, 232(4), 787-806.
10.Kaku, H., Nishizawa, Y., Ishii-Minami, N., Akimoto-Tomiyama, C., Dohmae, N., Takio, K., . . . Shibuya, N. (2006). Plant cells recognize chitin fragments for defense signaling through a plasma membrane receptor. Proceedings of the National Academy of Sciences, 103(29), 11086-11091. doi: 10.1073/pnas.0508882103
11.Maria Hayes, B. C. J. S. W. B. c. (2008). Mining marine shellfish wastes for bioactive molecules: Chitin and chitosan ndash; Part A: extraction methods. Biotechnology Journal, 3(7), 871-877.
12.Ohnuma, T., Onaga, S., Murata, K., Taira, T., & Katoh, E. (2008). LysM Domains from Pteris ryukyuensis Chitinase-A:A stability study and characterization of the chitin binding site Journal of Biological Chemistry, 283(8), 5178-5187.
13.Okada, M., Matsumura, M., Ito, Y., & Shibuya, N. (2002). High-Affinity Binding Proteins for N-Acetylchitooligosaccharide Elicitor in the Plasma Membranes from Wheat, Barley and Carrot Cells: Conserved Presence and Correlation with the Responsiveness to the Elicitor. Plant and Cell Physiology, 43(5), 505-512. doi: 10.1093/pcp/pcf060
14.Ozeretskovskaya, O. L., Vasyukova, N. I., Panina, Y. S., & Chalenko, G. I. (2006). Effect of immunomodulators on potato resistance and susceptibility to Phytophthora infestans. Russian Journal of Plant Physiology, 53(4), 488-494.
15.Shibuya, N., Kaku, H., Kuchitsu, K., & Maliarik, M. J. (1993). Identification of a novel high-affinity binding site for N-acetylchitooligosaccharide elicitor in the membrane fraction from suspension-cultured rice cells. FEBS Letters, 329(1–2), 75-78. doi: 10.1016/0014-5793(93)80197-3
16.Vasyukova, N. I., Zinov'eva, S. V., Il'inskaya, L. I., Perekhod, E. A., Chalenko, G. I., Gerasimova, N. G., . . . Ozeretskovskaya, O. L. (2001). Modulation of Plant Resistance to Diseases by Water-Soluble Chitosan. Applied Biochemistry and Microbiology, 37(1), 103-109.
17.Yin, H., Zhao, X., & Du, Y. (2010). Oligochitosan: A plant diseases vaccine—A review. Carbohydrate Polymers, 82(1), 1-8.
18.Zhao, X., She, X., Du, Y., & Liang, X. (2007). Induction of antiviral resistance and stimulary effect by oligochitosan in tobacco. Pesticide Biochemistry and Physiology, 87(1), 78-84.
การใช้ไคติน ไคโตซาน และ ไคโตโอลิโกแซคคาไรด์ เพื่อเพิ่มผลผลิตทางการเกษตร
9/14/2556
ผู้เขียน
พรศิริ เพชรศรีช่วง และมณฑารพ ยมาภัย
Useful Link