สรุป

มาลาเรียเป็นโรคที่เกิดจากเชื้อปรสิต Plasmodium ที่เกิดได้ทั้งในคนและสัตว์ ซึ่งยังเป็นปัญหาอย่างมากในประเทศเขตร้อนชื้นรวมทั้งประเทศไทย จากรายงานล่าสุดพบว่าโรคนี้มีอัตราการติดเชื้อสูงถึง 500 ล้านคนต่อปี และมีอัตราการตายมากกว่าหนึ่งล้านคน [1,2, {Santos, 2013 #451}] โดยโรคมาลาเรียที่เกิดจากเชื้อ P.  falciparum  เป็นชนิดที่ร้ายแรงที่สุด เนื่องจากมีการดื้อยาของเชื้อมาลาเรียชนิดนี้ต่อยาต้านมาลาเรียเกือบทุกชนิดที่ใช้ในปัจจุบัน รวมถึงการศึกษาด้านวัคซีนป้องกันโรคก็ยังไม่สำเร็จ นอกจากนั้นยุงซึ่งเป็นพาหะของโรคก็ยังดื้อต่อยาฆ่าแมลงด้วย  ดังนั้นจึงมีความจำเป็นอย่างเร่งด่วนที่จะต้องพัฒนายาใหม่และหาเป้าหมายใหม่ในการออกฤทธิ์ของยา  การพัฒนายาต้านมาลาเรียมีหลายวิธี เช่นการปรับเปลี่ยนและพัฒนาจากยาเดิมที่ใช้กันอยู่ การพัฒนายาให้มีความซับซ้อนน้อยลงและสังเคราะห์ง่ายขึ้น  รวมทั้งการหายาใหม่จากเป้าหมายใหม่  โดยเป้าหมายใหม่ที่น่าสนใจอันหนึ่งคือ เอนไซม์ ดีเอ็นเอเฮลิเคส (DNA helicase) ซึ่งเป็นเอนไซม์สำคัญในขบวนการต่างๆ ของดีเอ็นเอในเซลล์ของสิ่งมีชีวิตทุกชนิด รวมทั้งเชื้อมาลาเรียด้วย  DNA helicase ทำหน้าที่แยก DNA สายคู่ให้เป็น DNA สายเดี่ยวโดยการสลายพันธะไฮโดรเจน เพื่อใช้ในขบวนการ metabolism ของทั้ง DNA และ RNA [2] เช่น DNA replication, recombination, repair  ซึ่งเป็นกลไกที่มีความจำเป็นต่อการดำรงชีวิตของสิ่งมีชีวิตทุกชนิด  วงจรชีวิตของเชื้อมาลาเรียมีความซับซ้อน และมีขบวนการ ที่ต้องใช้ DNA helicase ในหลายขั้นตอน เช่น หลังจากที่เชื้อเข้าสู่เซลล์ตับ, ระหว่าง schizogony ในเซลล์เม็ดเลือดแดง, ระหว่าง gametogenesis, หลังจาก fertilization และ ใน oocysts  ดังนั้น DNA helicase จึงเป็นเป้าหมายที่ดีสำหรับการออกฤทธิ์ของยาต้านมาลาเรีย

ความรู้พื้นฐาน

มาลาเรียเป็นโรคที่เกิดจากเชื้อโปรโตซัว Plasmodium มี 5 species ที่ทำให้เกิดโรคในคน ได้แก่  Plasmodium falciparum, P. vivax, P. malariae, P. ovale และ P. knowlesi อัตราการติดเชื้อสูงถึง 500 ล้านคนต่อปี และอัตราการตายมากกว่าหนึ่งล้านคน [1,2, {Santos, 2013 #451}] P.  falciparum  เป็นชนิดที่ร้ายแรงที่สุด เนื่องจากมีการดื้อยาของเชื้อมาลาเรียชนิดฟัลซิปารั่มต่อยาต้านมาลาเรียเกือบทุกชนิดที่ใช้ในปัจจุบัน รวมถึงการศึกษาด้านวัคซีนป้องกันโรคก็ยังไม่สำเร็จ แม้ว่าปัจจุบันมีการผลิตวัคซีนที่กระตุ้รการป้องกันโดยการฉีด Plasmodium falciparum sporozoite โดยการให้ยุงกัด ก็ยังอยู่ในระหว่างอยู่ในระหว่างการทดลอง และต้องการการผลักดันให้มี phase 1 clinical trial {Seder,  #452} นอกจากนั้นยุงซึ่งเป็นพาหะของโรคก็ยังดื้อต่อยาฆ่าแมลงด้วย [6] การดื้อยาต้านมาลาเรียเกิดจากหลายปัจจัยเช่น การใช้ยาต้านมาลาเรียสำหรับ prophylaxis ที่ไม่เหมาะสม การใช้ยาไม่ครบตามปริมาณที่กำหนด ปรสิตมีการปรับปรุงสายพันธุ์ในระดับยีนและ metabolism เช่น chloroquine เป็นยาต้านมาลาเรียที่ราคาถูกและรักษาได้ผลดี แต่เมื่อปี 1957 พบว่ามีการดื้อยานี้เกิดขึ้นในประเทศไทย และในปี 1988 พบว่าการดื้อยากระจายไปเกือบทั่วโลก โดยยานี้จะขัดขวางการรวมตัวกันของ heme ซึ่ง heme เป็น by product  จากการสลาย hemoglobin โดย heme จะเป็นพิษต่อปรสิต การดื้อยาของ chloroquine พบว่าใน P. falciparum ที่ดื้อยา จะมีปริมาณยาไม่สูงพอที่จะทำหน้าที่ได้ จากการศึกษาพบว่ายีน pfcrt ซึ่งเป็น chloroquine resistant transporter เกิด mutation ขึ้น  หรือการดื้อยาของยาในกลุ่ม antifolates ซึ่งมีเป้าหมายที่ dihydrofolate reductase โดยการดื้อยาเกิดจาก point mutation ของยีนเป้าหมาย  [7]  ดังนั้นจึงมีความจำเป็นอย่างเร่งด่วนที่จะพัฒนายาใหม่และหาเป้าหมายในการฆ่าเชื้อใหม่ [8]  การพัฒนายาต้านมาลาเรียมีหลายวิธี เช่นการปรับเปลี่ยนและพัฒนาจากยาเดิมที่ใช้กันอยู่  การพัฒนายาให้มีความซับซ้อนน้อยลงและสังเคราะห์ง่ายขึ้น ตัวอย่างเช่น trioxalane derivative ซึ่งขณะนี้กำลังอยู่ในระหว่างการทำ clinical trials [2]  ดีเอ็นเอเฮลิเคส (DNA helicase) เป็นเอนไซม์สำคัญในขบวนการต่างๆ ของดีเอ็นเอในเซลล์สิ่งมีชีวิตทุกชนิด รวมทั้งเชื้อมาลาเรียด้วย โดยมีหน้าที่ในการแยก DNA สายคู่ให้เป็น DNA สายเดี่ยวโดยการสลายพันธะไฮโดรเจน เพื่อใช้ในขบวนการ metabolism ของทั้ง DNA และ RNA [2] เช่น DNA replication, recombination, repair และ transcription วงจรชีวิตของเชื้อมาลาเรียมีความซับซ้อน และมีขบวนการ replication ของเชื้อมาลาเรียเกิดขึ้นหลายที่ ดังรูปที่ 1 เช่น หลังจากที่เชื้อเข้าสู่เซลล์ตับ, ระหว่าง schizogony ในเซลล์เม็ดเลือดแดง, ระหว่าง gametogenesis, หลังจาก fertilization และ ใน oocysts [9] โดย DNA helicase จะมีการทำงานร่วมกับโปรตีนอื่นๆ เป็นกระบวนการร่วมกัน [10] โดยทั่วไปเอนไซม์นี้มีปฏิกิริยาสามขั้นตอน ขั้นตอนแรกเอนไซม์จะจับกับ nucleic acid substrate จากนั้นจะจับกับ NTP และเกิด hydrolysis ตามด้วยการแยกสาย DNA [8]  DNA helicase เป็นเอนไซม์ที่พบได้ในสิ่งมีชีวิตทั้งชนิดโปรแคริโอต และยูแคริโอต พบครั้งแรกในปี 1976 ใน Escherichia coli [11] ในสิ่งมีชีวิตแต่ละชนิดยังพบ DNA helicase ได้หลายชนิดด้วย [12] เช่นในมนุษย์ พบ DNA helicase อย่างน้อย 9 ชนิด [13] มีการประมาณว่า ใน eukaryotic และ prokaryotic genome มียีนที่ทำหน้าที่ สร้าง DNA helicase อยู่ถึง 1% ของยีนทั้งหมด [13]  การทำงานของดีเอ็นเอเฮลิเคส ต้องการ divalent cation และ nucleotide triphosphate ด้วย เอนไซม์นี้สามารถแบ่งเป็น 2 กลุ่มตามทิศทางการทำงานคือ 3' – 5' และ 5'– 3' DNA helicase ขึ้นกับทิศทางการทำงานและสายที่เอนไซม์เกาะ บางชนิดสามารถทำงานได้ทั้งสองทิศทางแต่พบไม่มาก [14] การยับยั้งการทำงานของเอนไซม์ DNA helicase สามารถทำได้โดยการใช้ยาปฏิชีวนะในกลุ่ม anthracycline  ตัวอย่างเช่น aclarubicin, daunorubicin สามารถยับยั้งการทำงานของ DNA helicase ใน Escherichia coli, SV40, HeLa cells และ P.  falciparum  [3,10,15] โดยยาในกลุ่มนี้จะจับกับ DNA ในสายทำให้มี melting temperature เพิ่มขึ้น และทำให้สภาพของ DNA เปลี่ยนแปลงไปโดยที่ DNA ที่จับกับ anthracycline จะเสียสภาพ ไม่สามารถบิดงอได้ หรืออาจยืดยาวผิดไป [8,17]

ปัจจุบันยีโนมของ P. falciparum clone 3D7 ได้รับการ sequence เรียบร้อยแล้ว [18]  จากนั้นจึงได้มีการศึกษาดีเอ็นเอเฮลิเคสจากการโคลนยีน เช่น Plasmodium falciparum DEAD-helicase 60 (PfDH60) เป็นดีเอ็นเอเฮลิเคสที่ได้จากการ express ดีเอ็นเอเฮลิเคส P.  falciparum (3D7) ใน E. coli expression system พบว่ามีน้ำหนักโมเลกุล 59.8 kDa สามารถทำงานได้ที่ pH 5.0-10.0 และพบในระยะ schizont และสามารถทำงานได้ทั้ง 2 ทิศทาง (bipolar) [19,20]  สำหรับ Plasmodium falciparum helicase 45 (PfH45)  เป็นเอนไซม์ที่พบในทุกระยะของการพัฒนาเชื้อที่อยู่ในเม็ดเลือดแดง [21] สำคัญในการอยู่รอดของปรสิต และกระตุ้นโดย substrate ที่เป็น fork like structure [22]

จากการศึกษาเอนไซม์ DNA helicase จาก P. falciparum ซึ่งทำโดยการเลี้ยงเชื้อมาลาเรียให้ได้จำนวนมากแล้วทำการสกัดแยกเอนไซม์ออกมาด้วยวิธีการ column chromatography พบว่ามี DNA helicase หลายชนิด โดยหนึ่งในเอนไซม์ที่สกัดแยกมาได้นั้นได้ตั้งชื่อว่า PfDH A ซึ่งเป็นเอนไซม์ที่พบในระยะ schizont  จากการวิเคราะห์คุณสมบัติทางชีวเคมีพบว่า มีน้ำหนักโมเลกุลประมาณ 90 kDa มีทิศทางการทำงานโดยแยกสาย DNA จากปลาย 3' ไปยังปลาย 5' ของเส้น DNA [3] แต่พบในปริมาณที่น้อยมาก จึงไม่สามารถวิเคราะห์ลำดับกรดอะมิโน และวิเคราะห์คุณสมบัติอื่นๆ ต่อได้  ดังนั้นโครงการวิจัยนี้จึงสนใจที่จะ clone, express และผลิต DNA helicase ให้ได้ปริมาณที่เพียงพอที่จะใช้ทำการทดสอบคุณสมบัติต่างๆ รวมศึกษาผลของยา และสารเคมีต่างๆ ในการยับยั้งทำงานของเอนไซม์  ซึ่ง helicase inhibitor ที่หามาได้อาจสามารถพัฒนาเป็นยาต้านมาลาเรียตัวใหม่ ต่อไปได้

เอกสารอ้างอิง

1. 1.Sachs J, Malaney P: The economic and social burden of malaria. Nature 2002, 415:680-685.
   

2. 2.Sahu NK, Sahu S, Kohli DV: Novel molecular targets for antimalarial drug development. Chem Biol Drug Des 2008, 71:287-297.
   

3. 3.Suntornthiticharoen P, Petmitr S, Chavalitshewinkoon-Petmitr P: Purification and characterization of a novel 3'-5' DNA helicase from Plasmodium falciparum and its sensitivity to anthracycline antibiotics. Parasitology 2006, 133:389-398.
   

4. 4.Pradhan A, Chauhan VS, Tuteja R: A novel 'DEAD-box' DNA helicase from Plasmodium falciparum is homologous to p68. Mol Biochem Parasitol 2005, 140:55-60.
   

5. 5.Pradhan A, Chauhan VS, Tuteja R: Plasmodium falciparum DNA helicase 60 is a schizont stage specific, bipolar and dual helicase stimulated by PKC phosphorylation. Mol Biochem Parasitol 2005, 144:133-141.
   

6. 6.Winstanley PA: Chemotherapy for falciparum malaria: the armoury, the problems and the prospects. Parasitol Today 2000, 16:146-153.
   

7. 7.John EH: Drug-resistant malaria - an insight. FEBS Journal 2007, 274:4688-4698.
   

8. 8.Tuteja R: Helicases-feasible antimalarial drug target for Plasmodium falciparum. FEBS Journal 2007, 274:4699-4704.
   

9. 9.White JH, Kilbey BJ: DNA replication in the malaria parasite. Parasitol Today 1996, 12:151-155.
   

10. 10.Bachur NR, Yu F, Johnson R, Hickey R, Wu Y, Malkas L: Helicase inhibition by anthracycline anticancer agents. Mol Pharmacol 1992, 41:993-998.
    

11. 11.Abdel-Monem M, Hoffmann-Berling H: Enzymic unwinding of DNA. 1. Purification and characterization of a DNA-dependent ATPase from Escherichia coli. Eur J Biochem 1976, 65:431-440.
    

12. 12.Matson SW, Kaiser-Rogers KA: DNA helicases. Annu Rev Biochem 1990, 59:289-329.
    

13. 13.Tuteja N, Tuteja R: Prokaryotic and eukaryotic DNA helicases. Essential molecular motor proteins for cellular machinery. Eur J Biochem 2004, 271:1835-1848.
    

14. 14.Vashisht A, Pradhan A, Tuteja R, Tuteja N: Cold and salinity stress-induced pea bipolar pea DNA helicase 47 is involved in protein synthesis and stimulated by phosphorylation with protein kinase C Plant J 2005, 77:76-87.
    

15. 15.Bachur NR, Johnson R, Yu F, Hickey R, Applegren N, Malkas L: Antihelicase action of DNA-binding anticancer agents: relationship to guanosine-cytidine intercalator binding. Mol Pharmacol 1993, 44:1064-1069.
    

16. 16.Wirth DF: Biological revelations. Nature 2002, 419:495-496.
    

17. 17.Priebe W: "Anthracycline Antibiotics" New Analogues, Methods of Delivery, and Mechanisms of Action. Washington DC: American Symposium Society; 1995.
    

18. 18.Gardner MJ, Hall N, Fung E, White O, Berriman M, Hyman RW, Carlton JM, Pain A, Nelson KE, Bowman S, et al.: Genome sequence of the human malaria parasite Plasmodium falciparum. Nature 2002, 419:498-511.
    

19. 19.Pradhan A, Tuteja R: Plasmodium falciparum DNA helicase 60 dsRNA- and antibody-mediated inhibition of malaria parasite growth and downregulation of its enzyme activities by DNA-interacting compounds. FEBS Journal 2006, 273:3545-3556.
    

20. 20.Shankar J, Tuteja R: UvrD helicase of Plasmodium falciparum. Gene 2008, 410:223-233.
    

21. 21.Pradhan A, Tuteja R: Bipolar, Dual Plasmodium falciparum helicase 45 expressed in the intraerythrocytic developmental cycle is required for parasite growth. J Mol Biol 2007, 373:268-281.
    

22. 22.Pradhan A, Hussain EM, Tuteja R: Characterization of replication fork and phosphorylation stimulated Plasmodium falciparum helicase 45. Gene 2008, 420:66-75.
    

23. 23.Yamabhai M, Emrat S, Sukasem S, Pesatcha P, Jaruseranee N, Buranabanyat B: Secretion of recombinant Bacillus hydrolytic enzymes using Escherichia coli expression systems. J Biotechnol 2008, 133:50-57.
    

งานวิจัยของเรา

    การวิจัยของเราเกี่ยวกับความพยายามหาเป้าหมายยารักษาโรคมาลาเรียตัวใหม่ เพื่อการพัฒนายารักษาโรคที่มีประสิทธิภาพมากกว่าวิธีการที่มีอยู่ในปัจจุบัน โดยมุ่งเน้นเป้าหมายที่เป็นเอนไซม์ในกลุ่ม DNA Helicase

ตอนที่ ๑ 

จากผลการศึกษาวิจัยเบื้องต้น โดย คณะของผู้วิจัยร่วม ได้ค้นพบ PfDH A เป็น DNA helicase ที่ได้จากเชื้อ P. falciparum ในระยะ schizont มีน้ำหนักโมเลกุลประมาณ 90 kDa มีทิศทางการทำงานโดยแยกสาย DNA จาก 3' – 5' DNA helicase [3] แต่พบในปริมาณที่น้อยมาก ดังนั้นจึงมีความจำเป็นที่จะต้องผลิตเป็น recombinant enzyme ให้ได้ในปริมาณมากเพียงพอ เพื่อใช้ในการศึกษาเกี่ยวกับกลไกการทำงานของเอนไซม์นี้ และคุณสมบัติต่างๆ  รวมทั้งศักยภาพในการเป็นเป้าหมายของยาตัวใหม่ และความสามารถในการถูกยับยั้งด้วย inhibitor ต่างๆ   โครงการวิจัยนี้จึงเป็นการศึกษาองค์ความรู้ใหม่เพื่อต่อยอดจากการค้นพบในเบื้องต้น ซึ่งเป็นการ clone, express และผลิต recombinant DNA helicase ให้ได้ปริมาณที่เพียงพอที่จะใช้สำหรับการทดสอบคุณสมบัติต่างๆ ดังกล่าว  ซึ่งนอกจาก helicase inhibitor ที่ค้นพบจากโครงการนี้อาจสามารถพัฒนาเป็นยาต้านมาลาเรียตัวใหม่ได้แล้ว  ยังเป็นการสร้างองค์ความรู้ใหม่เกี่ยวกับโครงสร้างและหน้าที่ของ DNA helicase รวมทั้งบทบาทของเอนไซม์นี้ในวงจรชีวิตของเชื้อมาลาเรียอีกด้วย

ตอนที่ ๒

เป็นการโคลน การแสดงออก และคุณสมบัติต่างๆ ของ DNA helicase จากยีน PfI0910w โดยได้ทำการโคลน และ แสดงออกโปรตีนสำเร็จได้ recombinant protein ขนาด 85.5 kDa DNA helicase ทำงานได้โดยการเกิด hydrolysis ของ ATP และทำงานลดลงเล็กน้อยเมื่อใช้ dATP และทำงานได้น้อยเมื่อใช้ dCTP, dGTP, dTTP และยังต้องการ Mg2+ และถูกยับยั้งการทำงานโดย 200 mM KCl, 200 mM NaCl และ EDTA เอนไซม์สามารถคลายเกลียว duplex DNA ทั้งสายสั้นและสายยาว Anthracycline เช่น daunorubicin และ doxorubicin สามารถยับยั้งการทำงานของเอนไซม์ได้ โดยมีค่า IC50 ของ daunorubicin และ doxorubicin เท่ากับ 30 และ 23 µM ตามลำดับ