เทคโนโลยีหนึ่งที่มีประสิทธิภาพสูงในการทำวิศวกรรมแอนติบอดีเพื่อผลิต antibody เพื่อการตรวจวิเคราะห์ และรักษา แนวใหม่ คือเทคโนโลยีเฟจ ซึ่งได้เริ่มต้นขึ้นตั้งแต่ปี ๒๕๓๓ [1]  ซึ่งเริ่มต้นขึ้นจากความเข้าใจโครงสร้างและกลไกการจัดเรียงตัวของยีนแอนติบอดีอย่างละเอียด โดยในขั้นแรกเป็นการสร้างคลังของ antibody จากสัตว์ที่ได้รับการกระตุ้นด้วย antigen  แล้ว  โดยทำการแสดงเฉพาะส่วนของ antibody ที่มีหน้าที่ในการจับคือ ส่วน Fab [2, 3]   หรือ สร้างเป็น antibody เส้นเดี่ยวที่มีเฉพาะส่วนที่มีหน้าที่ในการจับ เรียกว่าส่วน single chain variable fragments (form), scFv [1]   ซึ่ง antibody เหล่านี้จะถูกแสดงบนโปรตีนที่ปกคลุมผิวชนิดรอง (pIII)  พบว่ามีความสำเร็จจากการใช้คลังเหล่านี้ในการผลิต monoclonal antibody ต่อ antigen  หลายชนิด [4-11]  แต่ข้อจำกัดประการสำคัญของการใช้วิธีการนี้คือต้องทำการกระตุ้นสัตว์ทดลองก่อนจึงเป็นการเสียเวลา และยังเป็นคลังที่มีเฉพาะ antibody ที่เกิดจากการกระตุ้นด้วย antigen ที่ใช้  อย่างไรก็ตามความสำเร็จนี้นับเป็นเครื่องชี้ว่าสามารถนำเทคโนโลยีการแสดงโปรตีนบนผิวฟาจมาใช้ในการคัดเลือกและผลิต monoclonal antibody ที่มีความสามารถในการจับอย่างมีความเฉพาะเจาะจงสูงได้จริง

การพัฒนาก้าวสำคัญที่ทำให้การประยุกต์ใช้เทคโนโลยีฟาจในการผลิต monoclonal antibody เป็นที่แพร่หลายและได้รับความสนใจเป็นอย่างสูง ทั้งในงานวิจัยขั้นพื้นฐาน และการประยุกต์ใช้ในอุตสาหกรรมทางเทคโนโลยีชีวภาพด้านต่างๆ เริ่มต้นในเวลา ๒ ปีต่อมา เมื่อนักวิทยาศาสตร์สามารถสร้างคลังของ monoclonal antibody จากสัตว์ที่ไม่ได้รับการกระตุ้นภูมิคุ้มกันมาก่อนได้สำเร็จ (nonimmune library หรือ naïve library) [12]  คลังชนิดนี้สามารถประยุกต์ใช้ในงานวิจัยได้กว้างขวางกว่าคลังที่สร้างจากสัตว์ที่ได้รับการกระตุ้นภูมิคุ้มกันมาก่อนหลายเท่า เพราะสามารถใช้ในการสร้าง monoclonal antibody ต่อ antigen  เกือบทุกชนิดที่ต้องการ  เนื่องจากคลังของ antibody ที่สร้างขึ้นนี้เป็นตัวแทนความเป็นไปได้ทั้งหมดจากระบบภูมิคุ้มกันของสัตว์ตามธรรมชาติ  โดยพบว่า monoclonal antibody ที่คัดเลือกมาได้นั้นมีคุณภาพดีคือมีความสามารถในการจับ (affinity, ในช่วง 1-200 nM) และมีความจำเพาะเจาะจง (specificity) สูงเท่ากับ monoclonal antibody ที่สร้างจาก hybridoma [12-15]  อย่างไรก็ตามโดยทั่วไปแล้ว ความสามารถในการจับ และความสามารถในการยับยั้งการทำงานของ antigen (neutralizing) มักไม่ดีเท่า antibody ที่ได้จากคลังชนิด ทุติยภูมิ

เทคนิคทางพันธุวิศวกรรมอีกอย่างหนึ่งที่มีประโยชน์ในการสร้าง antibody ให้มีคุณภาพสูงคือมีความจำเพาะเจาะจง และความสามารถในการจับสูง (high specificity และ affinity) คือการนำ antibody ที่คัดได้จากคลังมาพัฒนาเป็น monoclonal antibody ที่มีคุณภาพดีขึ้น (maturation)  โดยใช้หลักการกำกับวิวัฒนาการ (directed evolution)  [16, 17]   ด้วยเทคนิคต่างๆ เช่น การทำให้เกิดการกลายพันธ์อย่างสุ่มด้วยเทคนิคทาง PCR ที่มีความแม่นยำต่ำ (error prone PCR) [18, 19]  หรือ การใช้เทคโนโลยีการสลับสับเปลี่ยนดีเอ็นเอ (DNA shuffling) [20-24]   การปรับปรุงคุณภาพด้วยวิธีนี้ โดยเฉพาะอย่างยิ่งโดยการสลับสับเปลี่ยนดีเอ็นเอ พบว่ามีประสิทธิภาพดีในการสร้าง antibody ที่มีความสามารถในการจับสูงมากขึ้นกว่าเดิมหลายเท่า  ตัวอย่างเช่นพบว่าสามารถเพิ่มประสิทธิภาพในการจับของ antibody บางประเภทได้ถึง ๑๐ เท่า ทำให้ได้ monoclonal antibody ที่มีความสามารถในการจับสูงถึง 1011 M-1 [25-27]  ซึ่งสูงกว่าค่าที่จะได้จาก monoclonal antibody ที่ผลิตด้วยวิธีการเดิม (คือ 1010 M-1)

นอกจากการปรับปรุงคุณภาพในการจับแล้ว ยังสามารถใช้เทคโนโลยีนี้ในการปรับปรุงคุณสมบัติอื่นๆตามวัตถุประสงค์ของการใช้งาน เช่นความสามารถในการทำงาน (function) ต่างๆ เช่นการกระตุ้นการส่งสัญญาณภายในเซลล์ (cell signaling) [28-35]   หรือการใช้เป็นตัวกระตุ้นหรือตัวยับยั้ง (agonist หรือ antagonist) โปรตีนหรือเอนไซม์ต่างๆในเซลล์ [36, 37]  นอกจากนั้นแล้วยังใช้ในการคัดเลือก antibody ที่ทนต่อสภาวะบางอย่างเช่น สภาวะกรด ด่าง หรือทนต่อเอ็นไซม์ที่ย่อยโปรตีน (proteinase) [38, 39]   หรือที่สภาวะ reducing [23] รวมทั้งการปรับปรุงให้มีคุณสมบัติเหมาะสมในการใช้เป็นยารักษาโรค (therapeutic use) [40-49]  หรือติดฉลาก (tag) [50-55] เพื่อประยุกต์ใช้ในงานวิจัยด้านต่างๆ

เอกสารอ้างอิง

[1] McCafferty, J., Griffiths, A. D., Winter, G., Chiswell, D. J., Phage antibodies: filamentous phage displaying antibody variable domains. Nature 1990, 348, 552-554.

[2] Chang, C. N., Landolfi, N. F., Queen, C., Expression of antibody Fab domains on bacteriophage surfaces. Potential use for antibody selection. J Immunol 1991, 147, 3610-3614.

[3] Hoogenboom, H. R., Griffiths, A. D., Johnson, K. S., Chiswell, D. J., et al., Multi-subunit proteins on the surface of filamentous phage: methodologies for displaying antibody (Fab) heavy and light chains. Nucleic Acids Res 1991, 19, 4133-4137.

[4] Bugli, F., Graffeo, R., Sterbini, F. P., Torelli, R., et al., Monoclonal antibody fragment from combinatorial phage display library neutralizes alpha-latrotoxin activity and abolishes black widow spider venom lethality, in mice. Toxicon 2008, 51, 547-554.

[5] Burton, D. R., Barbas, C. F., 3rd, Persson, M. A., Koenig, S., et al., A large array of human monoclonal antibodies to type 1 human immunodeficiency virus from combinatorial libraries of asymptomatic seropositive individuals. Proc Natl Acad Sci U S A 1991, 88, 10134-10137.

[6] Cai, X., Garen, A., Anti-melanoma antibodies from melanoma patients immunized with genetically modified autologous tumor cells: selection of specific antibodies from single-chain Fv fusion phage libraries. Proc Natl Acad Sci U S A 1995, 92, 6537-6541.

[7] Clackson, T., Hoogenboom,  H.  R.,  Griffiths,  A.  D.,  Winter,  G. , Making antibody fragments using phage display libraries. Nature 1991, 352, 624-628.

[8] Graus, Y. F., de Baets, M. H., Parren, P. W., Berrih-Aknin, S., et al., Human anti-nicotinic acetylcholine receptor recombinant Fab fragments isolated from thymus-derived phage display libraries from myasthenia gravis patients reflect predominant specificities in serum and block the action of pathogenic serum antibodies. J Immunol 1997, 158, 1919-1929.

[9] Kramer, R. A., Marissen, W. E., Goudsmit, J., Visser, T. J., et al., The human antibody repertoire specific for rabies virus glycoprotein as selected from immune libraries. Eur J Immunol 2005, 35, 2131-2145.

[10] Lee, M. S., Lee, J. C., Choi, C. Y., Chung, J., Production and characterization of monoclonal antibody to botulinum neurotoxin type B light chain by phage display. Hybridoma (Larchmt) 2008, 27, 18-24.

[11] Shaw, I., O'Reilly, A., Charleton, M., Kane, M., Development of a High-Affinity Anti-Domoic Acid Sheep scFv and its Use in Detection of the Toxin in Shellfish. Anal Chem 2008.

[12] Marks, J. D., Hoogenboom, H. R., Bonnert, T. P., McCafferty, J., et al., By-passing immunization. Human antibodies from V-gene libraries displayed on phage. J Mol Biol 1991, 222, 581-597.

[13] Nissim, A., Hoogenboom, H. R., Tomlinson, I. M., Flynn, G., et al., Antibody fragments from a 'single pot' phage display library as immunochemical reagents. EMBO J 1994, 13, 692-698.

[14] Sheets, M. D., Amersdorfer, P., Finnern, R., Sargent, P., et al., Efficient construction of a large nonimmune phage antibody library: the production of high-affinity human single-chain antibodies to protein antigens. Proc Natl Acad Sci U S A 1998, 95, 6157-6162.

[15] Winter, G., Griffiths, A. D., Hawkins, R. E., Hoogenboom, H. R., Making antibodies by phage display technology. Annu Rev Immunol 1994, 12, 433-455.

[16] Hoogenboom, H. R., Designing and optimizing library selection strategies for generating high-affinity antibodies. Trends Biotechnol 1997, 15, 62-70.

[17] O'Brien, P. M., Aitken, R. (Eds.), Antibody Phage Display, Humana Press, Totowa, New Jersey 2002.

[18] Fromant, M., Blanquet, S., Plateau, P., Direct random mutagenesis of gene-sized DNA fragments using polymerase chain reaction. Anal Biochem 1995, 224, 347-353.

[19] Martineau, P., Error-prone polymerase chain reaction for modification of scFvs. Methods Mol Biol 2002, 178, 287-294.

[20] Crameri, A., Cwirla, S., Stemmer, W. P., Construction and evolution of antibody-phage libraries by DNA shuffling. Nat Med 1996, 2, 100-102.

[21] Fermer, C., Andersson, I., Nilsson, K., Nilsson, O., Specificity rescue and affinity maturation of a low-affinity IgM antibody against pro-gastrin-releasing peptide using phage display and DNA shuffling. Tumour Biol 2004, 25, 7-13.

[22] Korpimaki, T., Rosenberg, J., Virtanen, P., Lamminmaki, U., et al., Further improvement of broad specificity hapten recognition with protein engineering. Protein Eng 2003, 16, 37-46.

[23] Proba, K., Worn, A., Honegger, A., Pluckthun, A., Antibody scFv fragments without disulfide bonds made by molecular evolution. J Mol Biol 1998, 275, 245-253.

[24] Zhang, X. X., Deng, Q., Zhang, S. Y., Liu, J., et al., Broadly cross-reactive mimotope of hypervariable region 1 of hepatitis C virus derived from DNA shuffling and screened by phage display library. J Med Virol 2003, 71, 511-517.

[25] Schier, R., Bye, J., Apell, G., McCall, A., et al., Isolation of high-affinity monomeric human anti-c-erbB-2 single chain Fv using affinity-driven selection. J Mol Biol 1996, 255, 28-43.

[26] Schier, R., McCall, A., Adams, G. P., Marshall, K. W., et al., Isolation of picomolar affinity anti-c-erbB-2 single-chain Fv by molecular evolution of the complementarity determining regions in the center of the antibody binding site. J Mol Biol 1996, 263, 551-567.

[27] Yang, W. P., Green, K., Pinz-Sweeney, S., Briones, A. T., et al., CDR walking mutagenesis for the affinity maturation of a potent human anti-HIV-1 antibody into the picomolar range. J Mol Biol 1995, 254, 392-403.

[28] Burtrum, D., Zhu, Z., Lu, D., Anderson, D. M., et al., A fully human monoclonal antibody to the insulin-like growth factor I receptor blocks ligand-dependent signaling and inhibits human tumor growth in vivo. Cancer Res 2003, 63, 8912-8921.

[29] Dauvillier, S., Merida, P., Visintin, M., Cattaneo, A., et al., Intracellular single-chain variable fragments directed to the Src homology 2 domains of Syk partially inhibit Fc epsilon RI signaling in the RBL-2H3 cell line. J Immunol 2002, 169, 2274-2283.

[30] Gejima, R., Tanaka, K., Nakashima, T., Hashiguchi, S., et al., Human single-chain Fv (scFv) antibody specific to human IL-6 with the inhibitory activity on IL-6-signaling. Hum Antibodies 2002, 11, 121-129.

[31] Kovaleva, M., Bussmeyer, I., Rabe, B., Grotzinger, J., et al., Abrogation of viral interleukin-6 (vIL-6)-induced signaling by intracellular retention and neutralization of vIL-6 with an anti-vIL-6 single-chain antibody selected by phage display. J Virol 2006, 80, 8510-8520.

[32] Li, Y., Li, H., Wang, M. N., Lu, D., et al., Suppression of leukemia expressing wild-type or ITD-mutant FLT3 receptor by a fully human anti-FLT3 neutralizing antibody. Blood 2004, 104, 1137-1144.

[33] Paz, K., Brennan, L. A., Iacolina, M., Doody, J., et al., Human single-domain neutralizing intrabodies directed against Etk kinase: a novel approach to impair cellular transformation. Mol Cancer Ther 2005, 4, 1801-1809.

[34] Piloto, O., Levis, M., Huso, D., Li, Y., et al., Inhibitory anti-FLT3 antibodies are capable of mediating antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity and reducing engraftment of acute myelogenous leukemia blasts in nonobese diabetic/severe combined immunodeficient mice. Cancer Res 2005, 65, 1514-1522.

[35] Willemsen, R. A., Ronteltap, C., Chames, P., Debets, R., Bolhuis, R. L., T cell retargeting with MHC class I-restricted antibodies: the CD28 costimulatory domain enhances antigen-specific cytotoxicity and cytokine production. J Immunol 2005, 174, 7853-7858.

[36] Rowley, M. J., O'Connor, K., Wijeyewickrema, L., Phage display for epitope determination: a paradigm for identifying receptor-ligand interactions. Biotechnol Annu Rev 2004, 10, 151-188.

[37] Xie, M. H., Yuan, J., Adams, C., Gurney, A., Direct demonstration of MuSK involvement in acetylcholine receptor clustering through identification of agonist ScFv. Nat Biotechnol 1997, 15, 768-771.

[38] Kristensen, P., Winter, G., Proteolytic selection for protein folding using filamentous bacteriophages. Fold Des 1998, 3, 321-328.

[39] Pedersen, J. S., Otzen, D. E., Kristensen, P., Directed evolution of barnase stability using proteolytic selection. J Mol Biol 2002, 323, 115-123.

[40] Almagro, J. C., Fransson, J., Humanization of antibodies. Front Biosci 2008, 13, 1619-1633.

[41] Benhar, I., Design of synthetic antibody libraries. Expert Opin Biol Ther 2007, 7, 763-779.

[42] Booy, E. P., Johar, D., Maddika, S., Pirzada, H., et al., Monoclonal and bispecific antibodies as novel therapeutics. Arch Immunol Ther Exp (Warsz) 2006, 54, 85-101.

[43] Hale, G., Therapeutic antibodies--delivering the promise? Adv Drug Deliv Rev 2006, 58, 633-639.

[44] Jolliffe, L. K., Humanized antibodies: enhancing therapeutic utility through antibody engineering. Int Rev Immunol 1993, 10, 241-250.

[45] McCarron, P. A., Olwill, S. A., Marouf, W. M., Buick, R. J., et al., Antibody conjugates and therapeutic strategies. Mol Interv 2005, 5, 368-380.

[46] Mitra, A., Nan, A., Line, B. R., Ghandehari, H., Nanocarriers for nuclear imaging and radiotherapy of cancer. Curr Pharm Des 2006, 12, 4729-4749.

[47] Reilly, R. M., Radioimmunotherapy of solid tumors: the promise of pretargeting strategies using bispecific antibodies and radiolabeled haptens. J Nucl Med 2006, 47, 196-199.

[48] Santos, A. D., Padlan, E. A., Development of more efficacious antibodies for medical therapy and diagnosis. Prog Nucleic Acid Res Mol Biol 1998, 60, 169-194.

[49] Stowell, C. P., Therapy with immunoglobulin: applications for monoclonal antibodies. J Infus Nurs 2006, 29, S29-44.

[50] Buscombe, J. R., The future of infection imaging. Q J Nucl Med Mol Imaging 2006, 50, 99-103.

[51] Carter, P., Merchant, A. M., Engineering antibodies for imaging and therapy. Curr Opin Biotechnol 1997, 8, 449-454.

[52] Filpula, D., Antibody engineering and modification technologies. Biomol Eng 2007, 24, 201-215.

[53] Howard, G. C., Kaser, M. R. (Eds.), Making and Using Antibodies: A Practical handbook, CRC 2006.

[54] Teillaud, J. L., Engineering of monoclonal antibodies and antibody-based fusion proteins: successes and challenges. Expert Opin Biol Ther 2005, 5 Suppl 1, S15-27.

[55] Van de Wiele, C., Revets, H., Mertens, N., Radioimmunoimaging. Advances and prospects. Q J Nucl Med Mol Imaging 2004, 48, 317-325.